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动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂说明

一、实验原理
真核生物的一切有核细胞都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶剂中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶剂经乙醇沉淀使DNA从溶剂中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂
1. 仪器:
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计、移液器、玻璃匀浆器、离心管(**)、吸头(**)
2. 试剂:
(1)细胞裂解缓冲液:
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
(2)蛋白酶K:称取20mg蛋白酶k溶于1ml**的双蒸水中,?C20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8.0):高压**,室温贮存。

(4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、

(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、**水。
三、操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K 
(500ug/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12~24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 重新溶解。3.加等量的酚:氯仿:异戊醇振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
4.取上层溶剂至另一管,加入等体积的氯仿?异戊醇,振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
5. 取上层溶剂至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm , 5min。
8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.汲取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
 

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